分光光度計技術(shù)原理、構(gòu)造及應(yīng)用
分光光度計技術(shù)原理、構(gòu)造及應(yīng)用
分光光度計原理是我們從事實驗室儀器研究和應(yīng)用的人員需要掌握的知識。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。該儀器是實驗室、科研機(jī)構(gòu)、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品廠、飲用水廠等機(jī)構(gòu)必備檢驗設(shè)備。已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。分光光度計基本原理是指采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系如下式：
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 ：
A 為吸光度；
I。為入射的單色光強(qiáng)度；
I 為透射的單色光強(qiáng)度；
T 為物質(zhì)的透射率；
k 為摩爾吸收系數(shù)；
L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長；
c 為物質(zhì)的濃度。
物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r操作。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
分光光度計原理說明的這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比，Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Tritonx-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry和BCA 兩種測試方法的2倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定１小時，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后1011分光光度計的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應(yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）
實驗室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計的重要配件——比色杯
比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應(yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。
由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如EppendorfUVette®塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，對此類科學(xué)的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學(xué)實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實驗室的必備設(shè)備之一。
分光光度原理
基本原理
利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計，這種分光光度計靈敏度高，測定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。
1. 光譜：
光是電磁波，可用波長“λ”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長的光譜所組成，對于生物化學(xué)來說，最重要的波長區(qū)域是可見光和紫外光。
光的波長是二個相鄰的波峰之間的距離。
光的傳播是由相互垂直的電場分量“E”和磁場分量“H”所構(gòu)成。
λ＝C/ν
λ——波長 C——光速 ν——頻率，單位時間通過一個定點的波數(shù)。
光又可以看作是由具有能量的粒子所組成。這些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：
E＝h•ν
H——普朗克常數(shù)（ 6.624×10-27爾格•秒）
ν——頻率
紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠(yuǎn)紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm波長的光，因此常規(guī)紫外測定集中在近紫外區(qū)，即200nm～400nm?？梢姽鈪^(qū)為400nm～800nm。
組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運動著，分子的運動可分為平動、轉(zhuǎn)動、振動和分子內(nèi)電子的運動，每種運動狀態(tài)都處于一定的能級，因此分子的能量可以寫成：
E＝E0+E平+E轉(zhuǎn)+E振+E電
E0是分子內(nèi)在的不隨分子運動而改變的能量，平動能E平只是溫度的函數(shù)，因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉(zhuǎn)動能量、振動能量和分子的電子能量。
分子的每一種能量都有一系列的能級，能級不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態(tài)，當(dāng)它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉(zhuǎn)動、振動和電子能級的躍遷，相應(yīng)地產(chǎn)生轉(zhuǎn)動、振動及電子光譜。
按照量子力學(xué)原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個能級間的能量差要符合下列關(guān)系：
E＝E2- E1＝h
E1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長愈長）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因為分子轉(zhuǎn)動、振動及電子能級躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動能級級差小，△E＜0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動光譜的吸收出現(xiàn)在遠(yuǎn)紅外或微波區(qū)。振動能級縱間的差別較大，E＝0.05～1.0 ev，振動光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。電子能級的級差更大， E＝1～20ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見、紫外或波長更短的光譜區(qū)。
分光光度計原理說明，可見光、紫外光吸收光譜，是由于分子中聯(lián)系較松散的價電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個低能級的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級軌道（稱為反鍵軌道）。
與吸收光譜有關(guān)的三種電子是：
⑴ 二個原子的電子沿其對稱方向相互形成的共價鍵（即單鍵），稱σ 鍵， 構(gòu)成 鍵的電子稱σ電子，如C－C、C－H鍵。
⑵ 平行于二個原子軌道形成的價鍵（即雙鍵），稱π 鍵，形成π鍵的電子稱為 π電子，如C=C鍵。
⑶ 未共享成鍵的電子，稱n電子。
各種電子躍遷所需能量大小的順序是：
n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ*
紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的π電子和未共享的電子對的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對的共軛情況等。
如下表所示：
電子躍遷類型與紫外吸收波長(nm)關(guān)系表
電子躍遷類型 例 子 紫外吸收波長范圍
σ→σ* C－H 100～150 nm
π→π*( 非共軛 ) C＝O ＜200 nm
π→π*( 共軛 ) ＝C－C＝ 200～300 nm
n→π* C＝O ～300 nm
π→π*躍遷：此類躍遷所需能量較小，吸收波長在紫外區(qū)的200～300
nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而200～300
nm的紫外吸收測定，在生化實驗技術(shù)中有極廣泛的用途。
若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長，并測定物質(zhì)對各種波長光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長λ作橫坐標(biāo)，“A”或“T”為縱座標(biāo)，畫出連續(xù)的“A~λ”或“T~λ”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。
吸光度 A
D
C
B
λmax λmin 波長(nm)
由上圖可以看出吸收光譜的特征：
⑴曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對應(yīng)的波長稱最大吸收波長，以λmax表示。
⑵曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對應(yīng)的波長，所對應(yīng)的波長，稱最小吸收波長，以λmin 表示。
⑶曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。
⑷在吸收曲線的波長最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當(dāng)強(qiáng)，但不成峰形，此處稱為末端吸收。
λmax是化合物中電子能級躍遷時吸收的特征波長，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，λmax、λmin、肩峰以及整個吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。
測定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對照，對照時須注意測定的條件，如溶劑、濃度等。
常用標(biāo)準(zhǔn)的紫處吸收光譜是薩德勒研究實驗公司編制的“Sadtler”紫外標(biāo)準(zhǔn)圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。
由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。
由于電子躍遷的同時也引起分子的轉(zhuǎn)動和振動光譜，要把電子躍遷和分子振動、轉(zhuǎn)動的躍遷完全分開是不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個或幾個寬的吸收譜帶所組成。
紫外光譜中常用的術(shù)語有發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。
發(fā)色團(tuán)：凡是與飽和碳?xì)浠衔镞B接能引起n→π*、π→π*、 n→σ*
等電子躍遷的基團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)。例如：C＝C、C＝O等發(fā)色團(tuán)。
助色團(tuán)：助色團(tuán)是一些具有非共價鍵的基團(tuán)（如OH、NH2、SH等）。這些基團(tuán)在波長＞200nm處沒有吸收，當(dāng)它與發(fā)色團(tuán)相連接時，使發(fā)色團(tuán)的吸收帶向長波移動，稱為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時吸收帶的強(qiáng)度增加。若助色團(tuán)與發(fā)色團(tuán)相連接，產(chǎn)生n→π* 躍遷，使吸收波長向短波移動，稱為蘭移（或深色效應(yīng)）。
增色效應(yīng)（hyperchromic effect）:
核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對紫外光的吸收明顯增加，即ε值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測量。
減色效應(yīng)（hypochromic effect）:
在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時ε值又明顯減少，回復(fù)到原來的核酸分子ε值較低的水平，即此時DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測量。
2. 光吸收定律：
朗伯——比爾（Lambert－beer）光吸收定律：
A＝－lgT＝εb c
A——吸光度，又稱光密度“O.D”。
T——透光度， T＝I / I。， I?！獮檎丈涞轿粘厣系墓鈴?qiáng)，I——為透過吸收池的光強(qiáng)。
ε——摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)（L•mol－1•cm－1）。
b——樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C——樣品濃度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“ε”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。
摩爾吸光系數(shù)：是物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測定的靈敏度就越高。ε值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常ε＝10～105：一般認(rèn)為ε＞ 104為強(qiáng)吸收；ε＝103～104 為較強(qiáng)吸收；ε＜ 102為弱吸收，此時分光光度法不靈敏。因為通常使用分光光度計可檢測出的最小吸光度A＝0.001, 所以，當(dāng)b＝1cm,ε＝105時，可檢測的溶液最小濃度是C＝10-8 mol/L。
常用的吸光系數(shù)還有一種百分吸光系數(shù)，即在某一波長下，溶液濃度為1%（W /V），液層厚度b＝1cm時的吸光度，以E1%λmax表示。
C——百分濃度（W / V）。
L——液層厚度，吸收杯光徑長度。 A——吸光度。
最大吸收波長λmax時的ε 和E1%λmax值可用下式換算：
ε＝E1%λmax×分子量 / 10
吸光度“A”有一個重要性質(zhì)是其具有加和性：
A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝
即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。
若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)ε相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例如，離子交換柱層析分離核苷酸實驗中可利用吸光度計算回收率：
m＝C•V ， ∵ ， ∴
m——溶質(zhì)的量 C——溶質(zhì)濃度
V——溶液體積 A——吸光度
ε——吸光系數(shù) b——吸收池光徑
∴ 回收率 （100%）
（上式中假設(shè)ε總和各核苷酸的ε近似相等）
例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定
260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù)
= 8.2×103 M－1cm－1（M＝mol / L）。
A＝ εbC ∵ A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）
A＝0.650－0.070＝0.580 ∵ b＝1cm
C==7.1×10－5 mol / L
例二：1%（W/V，10 mg /
ml）酪氨酸酶溶液的吸光度為24.9（1cm吸收池，280nm），計算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的濃度。
由于這兩種酶溶液的百分吸光系數(shù)“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法計算濃度。
C未知＝0.01％＝0.1mg / ml
分光光度計的組成和構(gòu)造
1.組成：各種型號的紫外/可見分光度計，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：（1）光源；（2）單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測器的光學(xué)系統(tǒng)）；（3）樣品室；（4）接收檢測放大系統(tǒng)；（5）顯示或記錄器。
國產(chǎn)分光光度計近年來已有很大的發(fā)展，各種檔次的分光光度計都已更新升級換代，可見光系列有：721、722、723等型號，紫外/可見光系列有：751、752、753、754、756等型號，主要生產(chǎn)廠為上海譜元儀器等。
瑞士KONTRON康強(qiáng)公司生產(chǎn)的UNICON860型紫/可見光分光光度計，是雙光束、快速自動掃描、熒屏顯示的高檔分光光度計。這種雙光束分光光度計的特點是來自光源的連續(xù)光譜經(jīng)凹面全息光柵分光后，由出射狹縫得到單色光，經(jīng)過由電機(jī)帶動的25周/秒左右的旋轉(zhuǎn)鏡分解為“樣品”、“參比”光束，順序分時通過參比池和樣品吸收池，照射到光電倍增管上，由于兩條光路是幾乎同時測量，參比信號又不斷與標(biāo)準(zhǔn)電壓比較，使參比信號恒定，所以由光源、單色器、外界雜光、光電倍增管以及電源電壓等帶來的影響，儀器均能自動消除。最快波長掃描速度為1200nm/min，有五種測量功能和五種數(shù)據(jù)處理功能。
200分光光度計的樣品和參比光路，分別有各自的帶溫控的光電二極管檢測器，因而取消了電機(jī)帶動的旋轉(zhuǎn)鏡，大大提高了儀器的穩(wěn)定性及各項檢測指標(biāo)，其波長范圍是190nm～1100nm，吸光度測定范圍是0～3A，可變狹縫寬度為1nm、2nm和5nm，儀器使用微機(jī)控制時，掃描速度最高可達(dá)6000nm/min，寬大的樣品室可以安裝各種附件，儀器性能優(yōu)良，適合教學(xué)、科研使用。該儀器的使用說明詳見附錄。
2. 構(gòu)造：
⑴ 光源：
理想光源的條件是：①能提供連續(xù)的輻射；②光強(qiáng)度足夠大；③在整個光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長有明顯變化；④光譜范圍寬；⑤使用壽命長，價格低。
用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長范圍是320～1100nm。由于能量輸出的波動為電壓波動的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。
用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuteriumlamp），適用波長范圍是195～400nm，由于氘燈壽命有限，國產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時左右，要注意節(jié)約燈時。
⑵ 單色器：
單色器是分光光度計的心臟部分，它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長。它的主要組成部件和作用是：
①入射狹縫——限制雜散光進(jìn)入。
②色散元件——即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。
③準(zhǔn)直鏡——把來自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。
④出射狹縫——只讓額定波長的光射出單色器。
轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵的波長盤，可以改變單色器出射光束的波長；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。
光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱的反射光柵或閃爍光柵）和凹面反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散元件和準(zhǔn)直鏡兩個作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，得到銳線光譜。
光柵的刻制方法有兩種：
機(jī)刻光柵：用金剛刀擠壓鍍于硬質(zhì)玻璃上0.5~1的鋁反射層而得。刻制工作量極大，一般每分鐘只能刻10條線，刻100mm寬的600線/mm的光柵要100小時。最多刻到3600線/mm。由于其制造周期長，成本高，一般只能制得少量的母光柵，而實際應(yīng)用的多是復(fù)制光柵，即在母光柵上涂上硅油，再鍍上一層鋁，用環(huán)氧樹脂粘下來，就得到復(fù)制光柵。機(jī)刻光柵的缺點是線槽稍有缺陷時就會出現(xiàn)“鬼線”，即位于光譜強(qiáng)線兩側(cè)的模糊不清的假線。
全息光柵：用全息照相法刻制的高精度光柵。即用高強(qiáng)度的相干性極好的單色光，如激光，用高分辨的感光材料——光致抗蝕劑記錄干涉條紋，曝光1小時，化學(xué)處理掉受光部分，再進(jìn)行真空鍍膜（鍍鋁），得到全息反射光柵。這種光柵幾乎沒有線槽間的周期誤差，幾乎沒有“鬼線”，雜散光很少。最大線槽密度可達(dá)6500線/mm，最大直徑可達(dá)400mm，刻線越多，分辨率就越高，最常用的是1200~1500線/mm的全息光柵。
狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率：
出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實際寬度，以毫米（mm）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，出射狹縫的寬度是6nm，并不是說出射狹縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜帶寬。
純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計所能得到的“單色光”，實際上只是具有一定波長范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長范圍也愈寬。
對單色光純度來說，狹縫是愈窄愈好，但光的強(qiáng)度也就越弱，因此狹縫不能無限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測器能準(zhǔn)確地進(jìn)行測量的最小光能量。目前達(dá)到的最小寬度為0.1nm。
光譜有效頻帶寬度“b’”——是檢測器檢測到的光能量為峰值一半處的二點間的波長間隔，如下所示：
光強(qiáng)度 P
b’ ——光譜有效頻帶寬（nm）
b ——狹縫寬度（mm） 1/2h
——線色散率 b’ 光譜有效頻帶寬b’
dλ——波長差 1/2h
dS——出射狹縫平面上二條 波長λ
光線（dλ）所分開的距離（mm）
由上式可以看出，b’與b成正比， 與線色散率成反比。線色散率越大，則可得到的有效頻帶寬度越小。
分辨率：是儀器對相鄰的兩個峰可分辨的最小波長間隔，是儀器分辨鄰近二條譜線的能力。
例如若可分開鈉雙線：則高的分辨率可達(dá)：R=105。所以，狹縫寬度b越小，光譜帶寬b’越小，分辨率就越高。
何種情況算是能夠分辨：定義為二條譜線的峰與谷處于同一位置時，此二個峰認(rèn)為是剛好能分辨。
由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫寬度對各種波長的光的測量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強(qiáng)能達(dá)到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。
⑶樣品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為0.1℃，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá) 0.05℃。
吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學(xué)玻璃杯因為普通光學(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長范圍是400nm～2000nm。石英玻璃杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm～3000nm。
吸收池的形狀有長方形，方形和園筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml），光程要求極精確，透光的玻璃面要嚴(yán)格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭頭“→”，標(biāo)明杯子使用時的透光方向，反方向使用會有偏差。
有各種用途的石英吸收池：如液體池、氣體池、微量池（容積5μl～1ml）、流動池（測量連續(xù)流動的樣品）、長光徑池（測量稀溶液用）、可裝拆池（便于清洗）等。石英杯通常還配有玻璃或塑料蓋，用以防止樣品揮發(fā)和氧化，以及杯內(nèi)樣品的快速混合。
吸收池使用注意事項：
① 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時可放在
1％洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個小刷子清洗杯子。
② 嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。
③ 嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。
④吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測定吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測定的吸光度為“A1”，則校正后的實際吸光度A為：A= A1－A0高檔的分光光度計有自動置零系統(tǒng)，可將二個杯子的偏差置零。
其他重要附件：
高檔分光光度計的樣品室還可以更換各種重要附件，用于各種特殊量測。如換上“積分球”，可用來檢測微弱透光和不透光的樣品。換上“凝膠掃描裝置”，可用于電泳凝膠膠條上樣品帶的掃描測量。
⑷ 檢測器：檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。
①光電管：光電管可檢測10微微安（10-11A）的光電流，管內(nèi)抽真空充入惰性氣體，常用國產(chǎn)真空光電管有GD-5蘭敏光電管（適用波長為210～625nm）；GD-6紅敏光電管（適用波長為625～1000nm）。751型分光光度計即使用這兩只光電管。
②光電倍增管：它是檢測弱光的最靈敏最常用的光電元件，其靈敏度比光電管高200多倍，光電子由陰極到陽極重復(fù)發(fā)射9次以上，每一個光電子最后可產(chǎn)生106～107個電子，因此總放大倍數(shù)可達(dá)106～107倍，光電倍增管的響應(yīng)時間極短，能檢測10-8～10-9秒級的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制，暗電流主要來自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。
③光電二極管：其原理是這種硅二極管受紫外～近紅外輻射照射時，其導(dǎo)電性增強(qiáng)的大小與光強(qiáng)或正比。近年來分光光度計使用光電二極管作檢測器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長，價格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計都在使用它作檢測器。尤其值得注意的是由于計算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，使用光電二極管的二極管陣列分光光度計有了很大的發(fā)展，二極管數(shù)目已達(dá)1024個，大大提高了分辨率。這種新型分光光度計的特點是“后分光”，即氘燈發(fā)射的光經(jīng)透鏡聚焦后穿過樣品吸收池，經(jīng)全息光柵色散后被二極管陣列的各個二極管接收，信號由計算機(jī)進(jìn)行處理和存儲，因而掃描速度極快，約10ms就可完成全波段掃描，繪出吸光度、波長和時間的三維立體色譜圖，可以最方便快速地得到任一波長的吸收數(shù)據(jù)，它最適宜用于動力學(xué)測定，也是高效液相色譜儀最理想的檢測器。
⑸ 顯示裝置：低檔分光光度計現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)。現(xiàn)代高性能分光光度計均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)，有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便（例如SPECORD200）。
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